Новый метод перепрограммирования ИПСК с помощью антител

Группа учёных из Исследовательского института Скриппса (The Scripps Research Institute, TSRI, США) создала новый метод перепрограммирования обычных взрослых клеток в стволовые. В исследовании, опубликованном 11 сентября 2017 года в Nature Biotechnology, учёные из TSRI изучили библиотеку из 100 миллионов антител. В результате они обнаружили несколько антител, способных помочь в перепрограммировании клеток кожи в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК).

Создание ИПСК из более зрелых клеток организма обычно состоит из включения генов четырёх транскрипционных факторов в ДНК репрограммируемых клеток. Антитела, идентифицированные исследователями, связываются с белками на поверхности зрелых клеток и могут применяться для их перепрограммирования в качестве замены трёх стандартных генов факторов транскрипции.

«Данный результат означает, что, в конечном итоге, мы сможем создать ИПСК, не затрагивая ядро клетки, что фактически говорит о том, что такие стволовые клетки будут иметь меньше мутаций и обладать лучшими свойствами», — сказала ведущий автор исследования Кристин Болдуин (Kristin Baldwin), доцент кафедры нейробиологии в TSRI.

Технология создания ИПСК, открытая доктором Шиньей Яманакой (Shinya Yamanaka) в 2006 году, требует внесения генов четырёх транскрипционных факторов (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) в ядро взрослой клетки с помощью лентивирусных векторных конструкций. Совместная экспрессия данных четырёх факторов (OSKM) запускает производство белков, которые выключают генетическое программирование взрослой клетки и переключают клетку в плюрипотентное состояние.

Технология позволяет создавать ИПСК пациентов для регенерации тканей и органов, используя различные источники получения клеток, включая кожу, кровь и даже мочу. Однако такой метод приводит к интеграции вектора в геном клетки, что может вызвать непредвиденные модификации его структуры и привести к развитию злокачественных образований. Кроме этого, сами вирусные конструкции являются антигенами для человека, что также небезопасно и ограничивает возможности практического применения ИПСК.

Одной из проблем данной процедуры является то, что вирусная инсерция или перепроизводство факторов перепрограммирования могут повредить ДНК клетки, превратив её в злокачественную. Другая проблема заключается в том, что ядерное перепрограммирование обычно производит набор ИПСК с переменными свойствами.

«Эта изменчивость может стать проблемой даже тогда, когда мы используем ИПСК в лаборатории для изучения заболеваний», — говорит Болдуин.

В отличие от данного метода, при естественном развитии клеточная идентичность меняется с помощью молекулярных сигналов, которые поступают извне клетки и изменяют активность генов без каких-либо рискованных включений ДНК.

Чтобы решить эту проблему, группа TSRI под руководством доктора Болдуин решила разработать альтернативный неинвазивный метод создания ИПСК. Учёные изучили огромную библиотеку антител – белков, которые распознают и связываются с конкретными молекулами, — чтобы идентифицировать те, которые смогли бы заменить факторы перепрограммирования OSKM.

Исследователи полагали, что некоторые из антител, связываясь с белками на поверхности клеток, могут включить сигнальный каскад снаружи, который активировал бы соответствующие перепрограммирующие гены изнутри клетки.

На начальном этапе эксперимента группа Болдуин пыталась идентифицировать антитела, которые могут заменить как Sox2, так и c-Myc. Учёные использовали большую популяцию фибробластов мышей, часто используемых для получения ИПСК в экспериментах, и ввели гены двух других транскрипционных факторов — Oct4 и Klf4. Затем они добавили свою огромную библиотеку генов антител к популяции клеток таким образом, чтобы каждая клетка в конечном итоге содержала гены одного или нескольких антител.

Затем исследователи наблюдали, какие из клеток начали формировать колонии стволовых клеток, указывая на то, что одно из продуцируемых антител успешно заменило функции Sox2 и c-Myc и вызвало изменения в клеточной идентичности. Секвенирование ДНК этих клеток позволило исследователям определить ответственные антитела.

Таким образом, команда TSRI обнаружила два антитела, которые могут заменить как Sox2, так и c-Myc. В аналогичных проведённых экспериментах они обнаружили два антитела, которые могут заменить третий фактор транскрипции — Oct4. Учёные продемонстрировали, что, вместо включения в ядро генов транскрипционных факторов, они могут просто добавлять антитела к культуре фибробластов.

В данном первоначальном исследовании учёным не удалось найти антитела, которые заменят функцию четвертого фактора транскрипции OSKM, Klf4. Тем не менее, Болдуин надеется, что при более широком скрининге она и её коллеги, в конечном итоге, найдут антитела, которые смогут заменить Klf4.

Другие исследовательские группы опубликовали различные неинвазивные методы перепрограммирования ИПСК, используя коктейли из химических веществ, белков или микроРНК вместо вирулентной доставки генов. Однако исследование Болдуин является первым использованием антител для достижения этой цели.

Дополнительным преимуществом перепрограммирования с помощью антител является то, что команда смогла больше узнать о сигнальных путях, которые были естественным образом активированы в данном методе.

Ученые обнаружили, что одно из антител, заменяющее Sox2, связывается на клеточной мембране с белком под названием Basp1. Этот процесс ограничивает его нормальную активность и таким образом снимает блокирование белка WT1, транскрипционного фактора, который работает в ядре клетки. Разблокированный WT1 изменяет активность множества генов, в том числе и Sox2, для превращения клеток в стволовые с использованием другого порядка событий, чем при применении исходных факторов перепрограммирования.

ИПСК, полученные с помощью перепрограммирования с использованием антител, могут решить некоторые из давних проблем, связанных с традиционными методами перепрограммирования, и могут предоставить дополнительную информацию о сложной сигнализации, которая необходима для превращения взрослой клетки в плюрипотентное состояние.

Болдуин и её команда в настоящее время занимаются поиском антител, которые будут перепрограммировать клетки человека (а не мыши) в ИПСК.